随着生物制药领域的快速发展，特别是单克隆抗体（mAb）作为治疗性药物的广泛应用，高效、稳定的纯化技术显得尤为重要。复合模式层析（Composite Mode Chromatography, CMC）作为一种创新的分离纯化策略，在单抗纯化过程中展现出了显著的优势。本文旨在探讨复合模式层析在单抗纯化工艺中的应用原理、特点及其在提高产品质量和降低成本方面的效果。

传统分离工艺依赖于多步单模式层析操作，每次都只针对蛋白质的一种特性进行分离。复合模式层析填料能够利用层析介质与蛋白之间含有的多种相互作用，实现目标物更好的分离。该方法可以通过多种相互作用吸附目标蛋白，又能在相对温和的条件下实现目标物的解吸，同时具有耐盐性，能够减少许多预处理步骤，避免增加额外的成本和产品损失，是对常规的单模式层析很好的补充。以下例举两个复合模式层析在单抗纯化中较为常见的应用方式。

一、SpreX MMC去除电荷异质体

单抗的三步纯化工艺通常使用亲和层析+阴离子层析+阳离子层析，其中阳离子层析的主要作用是去除电荷异质体。然而在部分单抗项目中电荷异质体由于带电性质与抗体蛋白十分接近，通过阳离子层析去除时难以实现较好的分离——要么选择高纯度低收率，要么选择高收率低纯度，此时SpreX MMC D40则可以作为一个很好的备选项进行尝试。尤其在双抗的纯化中，单独的疏水或离子作用难以去除的错配体，在复合模式层析下也变得更加简单。

SpreX MMC D40使用2-苯甲酰氨基-4-巯基丁酸作为配基，同时具有阳离子、疏水和氢键的作用，可以使用多种洗脱方式去除电荷异质体，理论上具有比单纯的阳离子层析更好的分离效果。

实际的工艺开发过程中，在结合洗脱模式下对电荷异质体杂质进行去除时通过对洗脱方式的优化来取得更好的分离效果。常规的有四种洗脱方式可供选择：①盐梯度洗脱，②不含盐的pH梯度洗脱，③含盐的pH梯度洗脱，④pH和盐双梯度洗脱。

然而也由于洗脱方式的选择太多，造成了复合模式下的层析工艺开发相比单模式下的层析更加复杂，常常作为其他方法行不通时的备选项。尽管应用起来有一定困难，其特殊的分离效果仍然在不少项目中得到了应用。

二、三步层析法替换为两步层析法

传统单抗纯化使用三步纯化方法，而在部分抗体项目中使用复合模式层析经过工艺优化后替换为两步法仍然能够满足质量的要求，从而在成本方面取得了更多的优势：减少了生产过程中的操作步骤，一方面降低了物料、设备和人力的消耗，同时也降低了操作过程中污染的风险，降低蛋白生产过程的成本，另一方面减少操作步骤也意味着减少了蛋白损失，提高了产品的收率。

在三步层析纯化方法中，亲和层析后的样品进行病毒灭活后还需要分别经过阴离子层析、阳离子层析以降低聚集体、HCP、DNA、proteinA以及电荷异质体等的含量，在制药中还要同时兼顾除病毒效果的要求。两步层析法一般都是以复合模式层析取代两步离子层析，此时复合模式层析阶段的纯化压力会更大，对复合模式层析填料以及纯化工艺提出了更高的要求。

SpreX MMA的配基同时具有阴离子、疏水和氢键等作用：阴离子作用在结合洗脱模式下对HCP、DNA以及proteinA都有很好的去除效果，疏水作用则适合于分离聚集体。通过一些层析条件的优化 ，只需一步即可达到较高的纯度。同时抗体在纯化阶段一般整体带正电荷，SpreX MMA的阴离子基团提供静电排斥作用可以使抗体蛋白更容易被洗脱，具有比SpreX MMC更高的回收率。

两步层析法虽好，但并非适用于所有抗体项目。在最终产品纯度要求下，上游培养收获样品杂质越多，对下游纯化压力越大。不应将所有压力都集中在下游纯化阶段，而是上游尽可能控制杂质种类和含量，甚至是在分子设计和表达阶段就为下游纯化作出考虑，下游则在满足纯度要求的前提下尽可能优化工艺、缩减成本。

三、复合模式层析工艺开发

尽管都知道复合模式层析相比于单模式层析拥有无可比拟的优点，但很多研发纯化人员看到复合模式的第一反应就是头疼，主要还是其工艺开发中影响因素较多，且各种因素之间交互作用比较复杂。

使用DOE实验来进行系统性的工艺开发，能够通过最少的实验次数来获取最多的工艺相关信息。以使用SpreX MMA进行流穿模式层析为例，其层析效果的主要影响因素包括上样pH、电导和上样体积，主要检测的指标则包括收率和HCP、DNA、protein A等的去除能力。

虽然不同单抗的等电点、带电性质以及样品中蛋白浓度和杂质含量的情况有所不同但通常差别并不大，因此DOE实验中各个条件的低值和高值依据经验可选择pH5.5-7.5，电导3ms/cm-15ms/cm，上样载量50mg/ml-150mg/ml。进行DOE实验后根据响应曲面和交互作用影响，平衡收率和杂质去除效果后选择相应纯化工艺。