Q:Ni离子填料是SpreX系列填料，为什么耐压只有0.3MPa？

F:基于SpreX Ni-NTA Elite/Max配基的偶联工艺以及特殊的使用方法，我们使用了和其他SpreX系列填料不同的化学处理工艺，因此在一些性能参数方面也有所不同。

Q:Elite和MAX的区别是什么？

A:MAX通过更高的配基密度来实现更高的载量，但副作用则是非特异性吸附也更强，使得纯化后样品纯度往往比Elite低。若客户只需要进行一步Ni离子层析获得样品来进行一些检测或实验，则推荐使用Elite，若客户对纯度要求很低或者在Ni离子层析之后还会用离子层析、疏水层析等进一步纯化，则也可以尝试MAX来提高纯化效率，推荐填料时仍然和Elite一起推荐。

Q:镍离子层析填料能够使用多少个循环？

A:其使用寿命取决于样品成分、清洁方法等。单次挂镍则一般3-5个循环后脱镍并使用1M NaOH进行一次彻底的消毒再重新挂镍。使用寿命具体数据还需要使用实际料液去测试。

Q:Ni离子填料应该使用什么清洁消毒方法？

A:正常轮次间的消毒使用0.1M NaOH浸泡15min即可充分杀菌并去除杂质，超过15min后的清洁效果提升很小。使用3-5个循环后进行脱镍，并使用1M NaOH进行消毒，随后再进行挂镍。

Q:Ni离子层析NTA配基理论上耐受的各种缓冲液或添加剂其浓度是多少？

A:还原剂：5mM DTE，5mM DTT，20mM β-mercaptoethanol，5mM TCEP

变性剂：8M urea，6M guanidine hydrochloride

洗涤剂：2% Triton X-100，2% Tween 20，2% NP-40，2% cholate Anionic Detergent，1% CHAPS Zwitterionic Detergent

添加剂：500mM imidazole，20% ethanol，50% glycerol，100mM Na2SO4，1.5M NaCl，1mM EDTA，60mM citrate

缓冲液：50 mM sodium phosphate,pH7.4,100 mM Tris-HCl,pH7.4,100 mM Tris-acetate,pH7.4,100mM HEPES,pH7.4，100 mM MOPS, pH 7.4

Q:层析填料装柱时的压缩比是多少？

A:Pocar系列yijiSpreX Ni-Elite/MAX、SpreX Ni-TED建议为1.10，其它SpreX系列填料建议为1.12

Q:Ni离子亲和层析填料配基的选择方法是什么？

A:粗略的可以按照原核细胞用NTA配基，真核细胞用TED配基进行推荐；实际情况中也有部分真核细胞培养没有太多还原剂，不需要使用TED配基，也有部分原核细胞表达的样品纯化需要加入EDTA等，需要使用TED配基。

Q:Ni离子填料与竞品对比在哪些地方有优势，哪些地方有明显的劣势？

A:1、部分项目中纯化后的纯度较低，推测是非特异性吸附较强；2、洗脱强度相对较高：大多数项目与其他竞品相差不大，而在部分项目中则需要500mM咪唑进行洗脱。洗脱液中含有太高浓度的咪唑可能会增加后续纯化步骤中的难度。

Q:镍离子层析填料有哪些配基？都有什么特点？

A:比较常用的有IDA、NTA、TED三种配基，其结合镍离子的能力依次增强，能够耐受的EDTA和还原剂也依次增强，而相对应的结合标签蛋白的能力也越来越弱。实际使用中需要视客户样品情况进行选择，没有绝对的优劣之分。

Q:镍离子层析有时候也叫亲和层析，为什么？

A:亲和层析是指利用分子间特异性结合的层析，例如配基是proteinA就叫ProA亲和层析，利用的是ProteinA和Fc片段的特异性结合；如果配基是镍离子，就叫镍离子亲和层析，利用的是Ni等金属离子与组氨酸上的咪唑环之间的特异性结合等，相对而言Ni离子亲和层析的特异性不如ProteinA亲和层析高。另外有时候亲和层析也会特指ProA亲和层析。

Q:镍离子层析填料有哪些应用场景？

A:只要是添加了his标签的蛋白都可以，包括酶、功能蛋白、多肽等等，但是否带有his标签是在细胞培养表达阶段就确定的，无法在纯化阶段进行添加，所以客户在是否使用镍离子层析填料问题上取决于蛋白本身的结构。如果蛋白没有添加His标签，除非已经证明其它纯化方法不行，否则基本不可能再回到培养阶段对细胞进行变更。

Q:镍离子层析的基本流程是什么？

A:对培养的样品进行离心或澄清并过滤后进入到纯化阶段。纯化基本流程：平衡→上样→平衡→洗杂→洗脱→清洁→保存，可根据实际使用和保存情况在使用前进行一次清洁。其采用的层析模式是结合洗脱模式，即目标物结合在层析柱上而杂质流穿，然后再将目标物洗脱从而达到纯化的目的。在洗脱阶段常使用高浓度咪唑来进行竞争结合洗脱，也可以通过改变pH使与Ni离子螯合的基团质子化来洗脱，与离子层析的洗脱方法十分相似。

Q:样品结合能力低，上样过程中目标蛋白流穿可能是什么原因？怎么解决？

A:先检查样品中是否有脱落的组氨酸标签，如果有则应改善培养工艺，若没有脱落的标签片段则检查平衡和上样pH,提高pH可以增加标签蛋白的结合能力。同时样品中的EDTA、咪唑，缓冲液中的枸橼酸都会影响标签蛋白与Ni离子的结合，降低这些物质的浓度，并避免使用枸橼酸体系的缓冲液。

Q:洗脱液中样品含量很低可能是什么原因？

A:首先检查上样载量是否过低，过低的载量也会导致收率降低，解决办法就是通过增加上样量或使用更小的层析柱来增加层析柱的载量。也有可能是洗脱强度不够，增加洗脱液中的咪唑浓度看是否有样品洗脱，考虑到后续纯化和蛋白稳定性，咪唑浓度上限一般为300mM左右，也可以更换结合能力较弱的镍离子配基。

Q:洗脱缓冲液中有多种杂质/电泳中有多条杂带是为什么？解决方法是什么？

A:可能是带有标签的氨基酸残基、通过离子作用或非特异性吸附结合的杂蛋白。对于氨基酸残基，可以在洗脱前增加一个洗杂的步骤将其去除；对离子作用和非特异性吸附的蛋白，可以在缓冲液中加入一定浓度的NaCl降低其结合能力。如果是因为清洁不彻底而残留的蛋白，则可以在清洁阶段使用去垢剂对填料进行更彻底的清洁。同时如果对样品纯度要求较高，镍离子层析也应结合其他方法对样品进行多步纯化，没必要在Ni离子层析这一步过度追求纯度。

Q:层析柱使用几次后变成白色是什么原因？填料还能用吗？

A:刚出厂的镍离子填料因为镍离子而呈现蓝色或绿色，使用3-5次后颜色变淡是由于镍离子脱落，这是正常现象。此时需要对镍离子进行脱镍后再生，其方法见填料说明书。如果脱落速度太快，比如1轮后就变成白色，应当怀疑是有浓度较高的金属离子螯合剂或者还原剂，建议在使用时避免高浓度的金属离子螯合剂和还原剂，或是更换稳定性更好的SpreX Ni-TED。

Q:层析柱使用几次后变成棕色或黑色是什么原因？填料还能用吗？

A:填料变成棕色或黑色，是由于样品中或缓冲液中含有还原剂将二价镍离子还原，此时填料已经丧失了结合His标签的能力。建议脱镍并清洗后再重新挂镍，并在使用时避免使用高浓度的还原剂，或更换更加耐受还原剂的SpreX Ni-TED。

Q:使用镍离子层析样品的收率很低是什么原因？

A:可能得原因有很多，蛋白的标签脱落、蛋白折叠后标签没有在蛋白表面、上样pH不低、样品中含有EDTA等都会影响蛋白与层析填料的结合，从而导致样品收率低。

Q:SpreX Ni-TED的载量这么低，为什么开发这样一款填料？

A:SpreX Ni-TED的配基相比NTA的配基其耐受EDTA和还原剂的能力更强，这是由于TED配基与镍离子间的螯合键数量为5，而NTA与镍离子间的螯合键数量为4。但这也导致TED配基螯合的镍离子剩余的能够螯合标签蛋白的位置只剩余1个，所以在相同的配基密度下其载量也更低。这是镍离子填料在稳定性与载量间进行的取舍。

Q:NTA、TED配基的镍离子填料都有了，IDA配基的填料为什么没有？

A:IDA配基由于和镍离子之间只能形成3个螯合键，稳定性较差，载量方面反而并没有比NTA配基高出太多。受限于实际使用中反复挂镍操作不便也会增加成本，目前最多使用的还是NTA配基，其次是TED配基。而毫厘目前正在不断推出新产品，如果客户需要也可以定做。

Q:粒径更加均一能够给Ni离子层析填料带来什么优势？

A:由于镍离子的洗脱方法是类似物竞争结合的方式，其峰型常常会有拖尾。而粒径更加均一的填料优势体现在镍离子层析中就是会使洗脱峰更加的尖锐，这能够减少样品体积并降低后续纯化的成本。

Q:如果申请试用，有哪些规格的预装柱？

A:目前毫厘能够提供的预装柱有1ml和5ml两种规格的预装柱，其它规格大小的预装柱可在沟通后提供。

Q:镍离子层析柱一次挂镍能够使用多少次？

A:这个使用次数在纯化不同的样品时差距很大，一般是3-5次。对于不同的样品，应当根据杂质残留情况、Ni离子脱落情况来决定多少个循环后进行重新挂镍。

Q:一般的使用缓冲液推荐什么？

A:平衡缓冲液使用20 mM PB, 0.5 M NaCl, 20-40 mM 咪唑，pH值7.4；洗脱缓冲液使用20 mM PB, 0.5 M NaCl, 500 mM 咪唑，pH值为7.4，对于不确定的样品可以进行梯度洗脱实验来确定最佳洗脱浓度。使用的缓冲液应避免引入枸橼酸缓冲体系。

Q:纯化过程缓冲液中加入NaCl的目的是什么？

A:加入NaCl是为了降低与层析填料非特异性结合的杂质，同时由于镍离子带有电荷，NaCl也能屏蔽杂质通过离子作用与镍离子或没有螯合镍离子的配基结合，从而提高洗脱样品的纯度。

Q:镍离子层析柱如何进行清洁？

A:镍离子层析填料在不脱镍的情况下使用0.1M NaOH清洁，在脱镍后可以使用1M NaOH来进行更加彻底的清洁，去除脂蛋白、内毒素等，或使用30%异丙醇去除通过疏水作用结合的蛋白和脂质。

Q:我的蛋白怎么达不到说明书上标注的载量？

A:不同的缓冲液条件、不同的样品组成、不同的实验条件都会影响填料载量。毫厘的产品说明书上标注的载量是使用His标签的标准蛋白溶液测试的动态载量，样品纯度比较高；而用户在使用实际料液进行上样时含有大量杂质，载量会受到一定程度的影响，其他条件如缓冲液、流速等也会与测试时有所不同。各种蛋白真实的载量需要有针对性的进行测试，产品说明书上的载量仅作为与其他产品进行对比时的参考。

Q:镍离子层析过程中为什么要避免使用枸橼酸缓冲体系的缓冲溶液？

A:因为枸橼酸能够电离出3个羧基，会与镍离子形成强度比较高的螯合，占据螯合的位置使目的蛋白无法与镍离子结合而流穿。同时应当避免的还有甘氨酸、精氨酸等其他具有高浓度电子供体基团的物质。

Q:得到的洗脱液中聚集体含量比较高怎么解决？

A:可在上样样品中加入适量甘油，可以防止蛋白质因为疏水作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高50%。也可以加入其它能够降低疏水作用的溶剂。

Q:进行一次循环后怎样才能在不脱镍的情况下进行充分的清洁？

A:去除沉淀或变性物质，可以尝试用 2 倍柱体积的 6M 盐酸胍或8M 尿素洗涤，然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。 去除疏水结合的物质，可以尝试 2 倍柱体积 1% Triton X-100 洗涤，然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。

Q:镍离子填料脱镍后可以螯合Fe3+、Co2+来进行层析实验吗？

A:可以螯合，这种做法的优点是可以根据杂质以及目的蛋白的情况灵活选择一些选择性较好的离子以获得较好的纯化效果，缺点则是其它螯合离子性能未经过测试，不确定性较高。

Q:镍离子层析填料一般需要多长的保留时间能够达到足够高的载量？

A:一般保留时间需要5分钟左右，后续可根据蛋白针对性的进行优化。保留时间越短则载量越低，保留时间越长载量越高，但会在10分钟左右达到最大值。

Q:进行几次循环后需要进行重新挂镍，发现镍离子挂不上怎么回事？

A:可能是由于使用过程中杂质结合在填料上未进行彻底的清洁。建议在脱镍后使用1M NaOH清洁后再尝试挂镍。

Q:脱落的镍离子可能会对产品的使用过程造成影响还能用镍离子纯化吗？

A:SpreX Ni Elite/MAX的镍脱落量非常少。若对Ni离子含量要求非常高，有多种解决方法:①在上样样品中加入一定浓度的金属离子螯合剂并使用耐受高浓度金属离子螯合剂的SpreX Ni-TED填料；②在层析柱后端串联一个未螯合镍离子的SpreX Ni-NTA层析柱来结合脱落的少量Ni离子；③Ni离子亲和层析往往一步无法达到纯度上的要求，还需要使用离子层析、疏水层析等进一步纯化，这些阶段也有很好的去除镍离子的效果。

Q:镍离子层析上样过程中压力很大怎么办？

A:镍离子层析通常被用于蛋白的粗纯阶段，上样的样品一般都是培养收获液经澄清过滤后的收获液或是盐析处理后的样品。此时的样品中可能含有较多的DNA等杂质使得样品粘度较高，从而导致上样过程压力较大。解决办法是将样品快速搅拌或是加入DNA水解酶以降低样品粘度

Q:蛋白质和镍离子亲和介质不结合如何解决？

A:1. 超声功率不对：超声破碎时如果功率过高会导致蛋白碳化，功率过小会导致破碎不充分，蛋白没有充分释放。应调整功率，同时在超声前加入溶菌酶。 2. 标签未翻译或标签被包裹在结构内部：使用western blot检测标签蛋白是否表达。检查质粒序列或将标签移到其它位置，标签移到其它位置仍被包裹在结构内部时就要将标签暴露出来，如用尿素变性，但尿素变性只有部分标签蛋白可以和亲和填料结合，如His标签和金属螯合介质，但GST标签和GST介质就无法亲和结合。 3. 结合缓冲液不合适及层析柱每平衡好：调整缓冲液，如金属螯合介质和His标签蛋白结合时，pH应在7.3-8.5之间。层析柱没平衡好，柱床体系种的环境，如pH，离子强度、起始咪唑强度过高等也会影响结合，因此层析上样前要充分平衡层析柱。 4. 结合时间不够：降低上样流速让蛋白和介质有充分的时间结合。 5. 层析介质选择不合适：选择亲和介质时要根据使用的情况，如蛋白的结构性质和缓冲液中的成分来进行选择。

Q:蛋白结合在柱子无法洗脱如何解决？

A:1. 蛋白和介质结合力过强：增加洗脱强度，比如His蛋白和镍柱结合，可以增加取代咪唑的浓度。 2. 蛋白聚集在层析柱上：通过调整层析过程的缓冲液来增加蛋白的稳定性，改善蛋白在层析柱上的状态。聚集在层析柱上时就要对层析柱进行CIP清洗。

Q:镍柱堵了怎么办？

A:柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。 上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，可以加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行)，仍然无法解决则加尿素变性，使其在变形环境下进行纯化。样品进行前处理时也应注意浓度不要太高，否则粘度也会增加，从而增大上样过程的反压。

Q:纯化的样品纯度低是什么原因？

A:1. 层析过程流速：调整层析过程的流速，流速影响蛋白质和介质的亲和力，层析时要选择合适的流速。 2. 柱床未充分淋洗：上样后要对柱床进行充分的淋洗，将未和介质结合的留在介质颗粒间隙、孔内的蛋白以及其它非特异性结合的杂质洗出来后再进行目的蛋白的洗脱。 3. 洗脱过程的影响：在洗脱过程中要选择合适的咪唑洗脱液来进行洗脱，建议通过梯度洗脱的方法来找到最合适的洗脱浓度，以及洗脱杂蛋白时的咪唑浓度，之后再优化成步级洗脱。

Q:蛋白之间、蛋白与其它杂质分子之间有非特异性结合如何解决？

A:优化缓冲体系，比如加入10%甘油等减少蛋白间的非特异性结合。

Q:蛋白质纯化过程中失活如何解决？

A:优化缓冲体系有利于提高蛋白的稳定性。蛋白在介质上的高密度下发生聚集沉淀，可以适当添加一定的增溶剂。有些蛋白在高温或常温下不稳定，需要在低温环境下进行上样和层析。

Q;SpreX Ni-NTA MAX的高载量会不会导致更高的非特异性结合？

A:会。蛋白质的非特异性结合是多个因素共同作用的结果，只有在其他杂质直接与Ni离子直接作用时才会导致更高的非特异性结合，更高的配基密度不仅更容易结合目的蛋白，也会更容易结合杂质，这也是MAX的纯度往往不如Elite的原因。SpreX Ni-NTA Max相比SpreX Ni-NTA Elite更加偏向于载量，适合于对纯度要求不高或是后续有其它纯化步骤的场景下使用，来提高亲和层析阶段的效率并降低成本。

Q:SpreX Ni-NTA MAX具有更高载量是否意味着需要更高的咪唑浓度来对蛋白进行洗脱？

A:需要。Ni离子层析使用咪唑的洗脱原理是咪唑的竞争结合，洗脱的浓度是一个范围。在这个范围内当Ni的浓度更高时也需要更高浓度的咪唑。

Q:如何测量洗脱液中Ni离子含量？

A:使用pH为4的缓冲液运行10倍柱体积后通过光谱法测量层析柱上的镍离子载量并与层析柱上镍离子的负载量进行对比。

Q:怎样从洗脱样品中去除咪唑？

A:使用脱盐柱进行脱盐去除的操作效率更高，也可以使用超滤管或者超滤膜包使用切向流过滤的方法去处，但效率较低，效果也较差。用户可以根据已有设备情况或者实验需求进行选择。