1993 年，Hamers Casterman 在骆驼体内发现了一种仅有两条重链的抗体分子，其结构显示比传统抗体更稳定，1995 年后，研究者在鲨鱼体内也发现了这种可以结合抗原的缺失轻链的抗体分子，后续研究人员通过基因重组表达技术得到了只含有重链可变区的单域抗体，VHH晶体为2.5nm，相对分子质量只有15000，因此也被称为纳米抗体（nanobody）又称纳米抗体（VHH）。

纳米抗体与传统抗体结构的差异

纳米抗体（NBS）是存在于骆驼中的重链抗体可变区片段（VHH）。NBS 结构呈椭圆形，是目前发现的具有较高亲和能力的最小抗体片段。相比于传统抗体，具有诸多优势：

1、相对分子质量低，一方面使得其具有更强的组织渗透能力，如穿透血脑屏障和进入实体瘤；另一方面其结构相对传统抗体更加简单，相比于传统抗体需要在真核细胞中进行表达，纳米抗体使用大肠杆菌和酵母表达体系等即可进行表达，大大降低了纳米抗体研发和生产的成本。

2、免疫原性低，由于人抗体（IgG）与驼类动物抗体的重链基因同源性高达 80%，并且纳米抗体只具有重链可变区，不具有 Fc 片段，不需要考虑 Fc 片段所引发的补体效应，因此，纳米抗体具有更低的免疫原性。

3、亲水性与高稳定性，传统抗体VH区域高度保守的疏水性残基在纳米抗体中被亲水性的残基所取代，从而极大增加了纳米抗体的水溶性，不易形成包涵体。纳米抗体在 CDR1 区和 CDR3 区之间增加了一对二硫键因此具有更高的稳定性，有文献报道纳米抗体可以耐受 50 ℃以上的高温，在 37 ℃存放一周其仍能保持高生物活性。

4、更高的结合活性：纳米抗体的 CDR1 和 CDR3比传统的单克隆抗体 VH 长，可以穿透到抗原的内部，对抗原的凹陷结构有更好的结合活性。

纳米抗体以上的几种优点使其在各个领域得到了快速的发展。

纳米抗体纯化

1、添加了特殊标签的纳米抗体：纳米抗体在进行表达时为了便于纯化，通常会添加His标签、GST标签、MBP标签等。然而由于添加标签会使纳米抗体作为药物注射到人体内时有难以预知的风险，因此添加了标签的纳米抗体分子主要是检测及其他用途。如将纳米抗体偶联在琼脂糖微球上用于捕获抗VHH抗体、ELISA检测方法的建立等。

在诸多分子标签中His标签是使用最广、应用十分成熟的一种标签。以携带该标签的纳米抗体分子纯化为例，使用Ni离子亲和层析介质SpreX Ni-NTA Elite一步即可得到较高纯度的样品，满足部分场景下的需求，如对样品的杂质含量有较高要求，则推荐使用阴离子流穿模式（Pocar Q）和阳离子结合洗脱模式（Pocar SP HP）相结合的方法对样品进一步精纯。毫厘科技使用微流控技术生产层析微球，微球粒径更加均一，从而为层析实验带来更好的杂质分离效果。

2、添加Fc片段的纳米抗体：纳米抗体添加Fc片段能够使其发挥ADCC和CDC效应，并且增加了其分子量，延长了纳米抗体在体内的半衰期，然而更大的分子量也使纳米抗体失去了其分子量小、穿透能力强的优势。但其相比于传统抗体，仍然有相对分子质量较小，以及更高的稳定性的优势。

例如2021年11月康宁杰瑞制药、思路迪医药和先声药业合作开发的抗PD-L1纳米抗体恩维达(Envafolimab,恩沃利单抗)在中国获批上市，是目前全球首个获批的皮下注射给药的PD-L1抗体，该药物便是采用了Fc融合蛋白的结构。

偶联了Fc片段的纳米抗体首选的纯化方法便是ProA亲和层析，一步即可从细胞培养收获液中得到纯度在90%以上的蛋白样品，已经能够满足部分检测等应用场景的需求。毫厘科技的SpreX ProA H60是一款耐碱的亲和层析填料，且载量能够达到70mg hIgG/ml介质以上，为亲和层析降本增效。

3、没有进行修饰的VHH纳米抗体。由于添加各种标签可能会对纳米抗体分子的使用造成影响，一些场景下需要使用没有任何标签的纳米抗体。利用抗VHH抗体作为配基的亲和层析填料能够特异性结合纳米抗体。然而此类层析填料并未解决耐碱性以及载量低的问题，使用代价较高。

据毫厘科技了解到的信息，目前有不少纳米抗体应用场景使用阴阳离子相结合的方法也能得到纯度在95%以上的案例。实际工艺开发过程中应当根据纳米抗体实际的带电性质使用阴阳离子流穿模式或结合洗脱模式，毫厘科技的离子层析填料微球通过微流控技术制造，粒径均一，能够为离子层析带来更高的纯度。

4、双特异性纳米抗体：纳米抗体其简单的分子结构、特异性结合能力，特别适合用于构建双特异性抗体。通过一条肽链将两个纳米抗体分子连接在一起，使其能够同时识别两种抗原，这种纳米抗体分子在检测领域已有不少的应用案例，并且在药用领域也有极大潜力。

传统的双特异性抗体由于通常都含有四条链，尽管有不少分子构建的方法来减少错配体的产生，但仍然治标不治本，错配体的去除依旧是传统双抗制备中一个十分棘手的问题。而通过肽链连接的纳米抗体分子因其结构简单，不会产生错配体，为分子制备和纯化带来极大的便利。

目前双特异性抗体大部分都采用添加His标签并使用SpreX Ni-NTA Elite/MAX等Ni离子亲和层析填料进行粗纯，并结合阴阳离子进行进一步纯化。由于亲和层析具有更强的特异性，结合双特异性纳米抗体特殊的结构，有案例将两种不同的标签分别添加在纳米抗体不同的VHH结构上，并连续使用两步亲和层析对抗体分子进行纯化，最后使用阴离子层析介质如Pocar Q在流穿模式下去除剩余少量杂质，得到纯度较高的样品。使用该方法能够大幅简化蛋白纯化的工艺开发。

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