在层析实验中，我们往往要在层析柱装填好后测试层析柱的对称性和柱效，确保层析柱装填足够均匀来满足层析的实验要求。目前已经有了一套非常完善的流程，包括柱效测试程序、对称性和柱效的计算方法以及判定层析柱装填是否合格的标准。下面简述一下该流程：

使用水平衡并使用1-3%的丙酮上样，或使用0.4M NaCl平衡并使用1M NaCl上样，根据得到的相应UV峰或电导率峰来计算对称性以及柱效，计算方法如下：

柱效计算：   

式中： 

N ——理论塔板数 

VR ——进样点到色谱峰极大点的距离，单位为毫米（mm） 

Wh/2 ——半高峰宽，单位为毫米（mm） 

HETP ——理论踏板高度 

L ——柱高，单位为厘米（cm） 

N ——理论塔板数 

式中： 

As ——非对称因子 

a ——峰高为10%时所对应的左半峰宽，单位为毫米（mm） 

b ——峰高为10%时所对应的右半峰宽，单位为毫米（mm） 

柱效评价：通常情况下，HETP 的数值小于5倍介质平均颗粒大小，且非对称因子在 0.8~1.8 之间（越接近于1越好），则说明装柱效果较好。

以上计算方法在层析程序中都已有设定好的计算方法，不需要实验人员进行十分复杂的计算。更高的柱效意味着峰形更加尖锐，对称性越接近1就代表着层析柱装填上下更加均一。合格的柱效和对称性能够帮助层析过程中实现更高的峰分离效果。

然而相信不少人都疑惑过：理论塔板高度的计算方法从何而来？为什么能够代表层析柱装填效果？对称性的标准中为什么对拖尾现象容忍度比前倾现象更高？为什么使用蛋白进行层析时的峰形和测柱效时的峰形完全不同？相信都能在这里找到答案。

一、塔板理论

在化工领域，经常会使用精馏塔来分离一个混合物中不同组分，下图就是其主要结构，有许多的塔板。液相自上而下，气体自下而上，每经过一层塔板都会经历一次再分配，从而使精馏塔的不同高度处有不同的温度，并在不同位置处收集到对应温度的组分。

层析分离的过程虽然与其原理完全不同，但其分离过程的宏观表现却又与精馏塔十分相似。1941年马丁和辛格提出了塔板理论，将层析柱看做一个精馏塔，并引入理论塔板高度和理论塔板数来评价层析柱的好坏。

塔板理论成立四个基本的假设条件：①层析柱中存在类似精馏塔中结构的塔板，流动相的组分在单层“塔板”之间能够达到分配平衡；②样品中各组分从第0层塔板开始移动，并且样品的轴向扩散可以忽略不计；③把流动相进入层析柱的过程视为不连续的，并且每次只进入一个塔板的体积；④分配系数在每一层塔板上都相同，与组分的总量无关。

以上的假设条件是进行一系列层析柱效计算的前提。然而在实际的层析过程中，每一层理论塔板之间并不存在实际的界限，上样过程也是连续的，分配系数也不可能完全和组分的总量无关。因此在层析柱柱效测定实验中需要限定测试程序的方法，使样品在层析柱上的过程尽量接近该理论假设的条件，比如使用1M NaCl上样时需要0.4M NaCl的氯化钠来屏蔽层析基质与离子的作用、上样体积应控制在1%柱体积、洗脱流速应当降低等等。

当然在实际的层析柱中实际是不存在塔板的，理论塔板高度和理论塔板数只是塔板理论根据柱效测定的峰形，来反推出流动相中各组分经历了几次再分配的过程从而得出的一个模拟结果，并以此为依据来评价层析柱装填的好坏。

理论塔板高度在理论上的极限是塔板高度等于填料粒径，但实际上受到填料本身特性、装柱以及层析过程中受到各种因素的影响，一般都是在3-5倍粒径之间。

二、层析柱效

前面提到的柱效计算方法被称为Pulse test，是现在应用比较多的计算层析柱效的方法，其主要思路是采用色谱峰的保留时间近似为色谱峰函数的均值，利用理想高斯曲线近似的思想，将色谱峰的半峰宽近似校正为色谱峰的峰方差。这种方法计算起来简单方便，但是由于只考虑了色谱峰峰形中半峰宽的影响，而其他色谱峰的重要指标包括拖尾因子、对称性等没有考虑，因此在评价装柱效果时应当结合柱效以及对称性综合考虑。

下图展示了流动相的分子在填料颗粒之间的流动。在流道变窄的地方液体流速增加，大分子被拖在最后；在流道较宽的地方流速则减低，大分子则跑在前方。这种效应无论流动相的流速快慢都始终存在，且受层析填料颗粒的均匀程度以及堆叠方式影响非常大。当体现在实际的层析过程和层析图谱中，则表现为涡流扩散越严重，则分子分离效果越差；反之涡流扩散越轻微，则分子分离效果越好。毫厘科技实用微流控技术制球方法，得到的微球粒径非常均一，可以显著降低层析过程中的涡流扩散效应，提高层析柱的分离效果。

三、不对称性

不对称性是层析柱峰形前后形状是否一样，主要受层析柱上下装填是否均一的影响。根据其计算方法，不对称性数值大于1时表明峰拖尾；当数值小于1时表明峰前倾。当我们排除其它因素，只考虑层析柱上下是否均一时，层析柱的峰形有拖尾峰和前倾峰。当出现拖尾峰时是由于层析柱下紧而上松；反之当出现前倾峰时则表明层析柱上紧而下松。

拖尾和前倾的出现都会严重影响层析柱的分离能力。拖尾现象出现有多种原因，首先是柱外效应，样品在管道中的扩散、检测器的信号延迟以及层析柱外连接管的体积等等，是导致拖尾现象出现的主要原因。现在随着层析设备的发展，这些影响因素的影响已经降低到了很低的程度。

除了设备本身的影响外，色谱介质表面的吸附-解吸附的过程也会引起拖尾现象。层析介质表面修饰不均匀、不同条件下样品与配基的吸附能力不同，都会导致在洗脱阶段部分样品需要更长的时间来从层析柱上解吸附从而导致拖尾现象的出现。让我们再次把目光放回到层析柱柱效的测试方法，如果使用1-3%的丙酮来上样时使用纯化水作为平衡液，而使用1M NaCl作为上样样品时就需要使用0.4M NaCl来作为平衡液，就是因为丙酮与填料基质之间作用力非常小；NaCl则往往有较多的电荷作用加剧拖尾现象，0.4M NaCl可以一定程度上屏蔽这种作用，使得测试结果更加准确。

由于不对称性这个用于评价层析柱装填是否对称的参数还会受到其它几种因素的影响，并且上述几种方法只能一定程度上减轻拖尾现象，为了使该参数更加符合实际情况，对层析柱不对称性评价的标准进行了修正，即0.8-1.8，对拖尾的接受度更高而对前倾的接受度更低。

3.1轴向不均性

轴向不均性是指沿柱管中心轴的方向上层析填料装填是否均一，用不对称性描述。在装填层析柱的过程中，层析介质低端和顶端所受的力不可避免的出现不同，是导致层析柱出现轴向不均性的主要原因。为了减轻这种现象，在装柱过程中可以根据填料性质使用20%乙醇或一定浓度的氯化钠、缩短装柱的时间、提高填料悬液比等方法。但是这些措施又会使层析柱的柱效降低，所以需要装柱者根据需要来进行取舍。

3.2径向不均性

层析柱装填时，受装柱压力、装填时间、色谱柱柱管材料以及填料自身特性的影响，会产生径向的不均一性，一般来讲在层析柱中心处理论塔板高度较低，也即柱效率更高；在近壁处的理论塔板高度较高，也即柱效率更低。这种差距随着层析柱直径变大也会更加明显。

此外液体在层析柱中的流动也不是均匀分布的，存在着径向不均一的特性。液体流速在层析柱中呈现抛物线型的分布规律，即在中心处更大而在近壁处更小。

以上两种径向分布不均的特性一方面使峰形拖尾现象的加剧，造成了层析柱分离效率的降低，另一方面也导致了相同的层析工艺在不同规模层析柱上不同的表现。

四、层析柱柱高

在液相色谱中小分子的传质速率非常快，甚至可以看做是瞬间完成，其分离效果的好坏依赖于溶质扩散或流动相和固定相的动力学因素。分离度正比于塔板数或柱高这一规律仅适用于小分子溶质的分离。当然当柱子太高时由于分子轴向扩散的影响，反而会对分离过程造成副作用。

对于大分子来说，洗脱过程中传质过程与分子迁移规律与小分子有很大区别。以蛋白质为例，其洗脱过程是逐步进行的，当流动相条件不处于洗脱的范围时蛋白质不移动；当溶液条件进入洗脱的范围时蛋白质和流动相以相同速度移动。此时高柱高对蛋白在两相之间的分配不仅起不到有利的作用，相反由于在层析柱中区带展宽更加严重从而造成蛋白质分离度的下降。这也就是有时使用低柱高的层析柱分离效果与高柱高时相同的原因。

当然在实际使用过程中还要考虑工艺放大时层析柱的体积、层析柱的反压等因素，因而层析柱的柱高根据经验一般都设定为15-20cm左右。

以上可以看出粒径均一对于层析柱的影响是多方面的，毫厘科技提供的各种微球都是基于微流控技术制造，具有粒径均一的特性，能够为层析过程带来更简单的装柱、更高的柱效，并且填料耐药性良好、粒径均一的特性可以在大规模层析中改善液流情况，降低工艺放大的难度。同时在目前产品的基础上，还可以提供粒径更加均一的基球，满足客户各种个性化的需求。